布魯氏菌野毒株、疫苗株S2檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：布魯氏菌野毒株、疫苗株S2型檢測試劑盒（雙色實時熒光PCR法）

英文名稱：Brucella wild strain, vaccine strain S2 type Detection Kit (Dual Chanel Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預期用途】

布魯氏菌野毒株、疫苗株S2（Brucellosis）是由布魯氏菌野毒株、疫苗株S2（Brucella）引起的畜源性人畜共患傳染病，在牛、羊、豬中常發(fā)生，患病家畜是人類布魯氏菌野毒株、疫苗株S2病的主要傳染源。近年來全國各地布魯氏菌野毒株、疫苗株S2病疫情有上升的趨勢，給畜牧業(yè)發(fā)展及人類身體健康帶來極大的危害和威脅，造成巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的公共衛(wèi)生問題。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測布魯氏菌野毒株、疫苗株S2型，對布魯氏菌野毒株、疫苗株S2型的診斷和監(jiān)控具有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對布魯氏菌野毒株、疫苗株S2基因設(shè)計特異性引物和分子信標探針，在待檢樣本中含有布魯氏菌野毒株、疫苗株S2DNA的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應熒光信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含布魯氏菌野毒株、疫苗株S2靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 如使用原始標本進行檢測。標本（病人腦脊液、靜脈血、關(guān)節(jié)液；病畜靜脈血，乳汁；菌落，菌苔等）應為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標本。

2. 如需在增菌后進行PCR檢測，則應使用選擇性增菌液對原始標本進行增菌。

3. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

（4）蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可，具體操作按照其試劑盒說明書操

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為10³ Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；

2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；

3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應立即對工作臺清潔；

4. 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；

5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放；

7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；

8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。