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布魯氏菌檢測試劑盒(實時熒光PCR法)說明書

更新時間:2025-04-23點擊次數(shù):337


布魯氏菌檢測試劑盒(實時熒光PCR法)說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:布魯氏菌檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

英文名稱:Brucella Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/ & 50T/

【預期用途】

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的畜源性人畜共患傳染病,在牛、羊、豬中常發(fā)生,患病家畜是人類布魯氏菌病的主要傳染源。近年來全國各地布魯氏菌病疫情有上升的趨勢,給畜牧業(yè)發(fā)展及人類身體健康帶來極大的危害和威脅,造成巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的公共衛(wèi)生問題。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測布魯氏菌,對布魯氏菌的診斷和監(jiān)控具有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒針對布魯氏菌基因設計特異性引物和分子信標探針,在待檢樣本中含有布魯氏菌DNA的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應熒光信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號

組成

25T/

50T/

1

  布魯氏菌 PCR反應液

500 μL×1

1000 μL×1

2

布魯氏菌 陽性對照

40 μL×1

 40 μL×1

3

布魯氏菌 陰性對照

40 μL×1

 40 μL×1

4

說明書

1

1

注:陰性對照為滅菌純水,陽性對照為含布魯氏菌靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 如使用原始標本進行檢測。標本(病人腦脊液、靜脈血、關(guān)節(jié)液;病畜靜脈血,乳汁;菌落,菌苔等)應為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標本。

2. 如需在增菌后進行PCR檢測,則應使用選擇性增菌液對原始標本進行增菌。

3. 標本收集后若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存于-20℃~-80℃。

【檢驗方法】

1. 試劑準備(試劑準備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

2)核算當次實驗所需要的反應數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T+陽性對照數(shù)(1T+誤差預留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

PCR反應液(UNG酶及Taq酶)

20 μL

3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

4)蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備(樣本處理區(qū))

DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可,具體操作按照其試劑盒說明書操

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCRPCR擴增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序。

2)按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

 

反應體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集布魯氏菌熒光信號

PCR

反應

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

372分鐘(min

1

預變性

95℃:3分鐘(min

1

PCR擴增

95℃5秒(s

40

55℃40秒(s

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,設置淬滅基團選擇None

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct≤35

2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定:

1)陽性:標本檢測結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長期。

2)可疑:標本檢測結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測,如重復實驗結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

3)陰性:標本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標本檢測結(jié)果解釋

FAM

陽性(+

標本中檢出布魯氏菌

陰性(-

標本中未檢出布魯氏菌

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為103 Copies/mL,產(chǎn)品CV3%

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室,應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理;

2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理;

3. 各區(qū)域物品均為專用,不得交叉使用,以免污染;檢測結(jié)束后,應立即對工作臺清潔;

4. 吸取反應液時,應盡量避免產(chǎn)生氣泡;上 PCR 儀前,應注意檢查各反應管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確;

5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心;

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),并單獨存放;

7. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記;

8. 檢測過程中使用過的吸頭,應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測結(jié)束的PCR 反應管,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄;工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒;

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設置;不同批號試劑不能混用;并在有效期內(nèi)使用。

 

 

 

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