孔雀石綠ELISA試劑盒操作說明

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測測樣本中的孔雀石綠。（ MalachiteGreen oxalate ，MG)，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的孔雀石綠和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含孔雀石綠含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中孔雀石綠的殘留量。

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.025ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃， 30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

魚/蝦…………………………0.1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

 2.5 樣本回收率：

魚/蝦等水產(chǎn)品、水樣……………85%±15%

3 試劑盒組成                                                                                                                

酶標板………………………………96孔

高濃度標準品溶液1瓶（1ml/瓶）：10ppb（高標準液有揮發(fā)性，需注意密封）

標準品溶液0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb、0.4ppb（均為空瓶子，現(xiàn)配現(xiàn)用）。

酶標記物（紅蓋）…………………11ml

抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

助溶劑（黃蓋）………………………6ml

氧化劑（黑蓋）………………………6ml

10X復(fù)溶液（黃蓋）…………………20ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙腈（色譜純）、乙酸乙酯、甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：1×樣品復(fù)溶液

以100 ml為例，取10 ml 10×復(fù)溶液加入50ml去離子水和40ml甲醇，充分混勻。

配液2：1×工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 魚、蝦

1）取勻質(zhì)無骨的樣品1 g，加入50 ml離心管中，加入0.3 ml 乙腈、6 ml乙酸乙酯，充分震蕩（不少于5分鐘，確保魚肉沒有結(jié)塊）；

2）室溫下4000r/min 離心10min，取上清液3 ml加入10ml玻璃試管中，再加入氧化劑50 ul，震蕩2分鐘；

3）每管加入助溶劑50 ul(不振蕩)，50℃水浴環(huán)境下氮氣吹干（吹完之后管底部應(yīng)該有一滴液狀物，當(dāng)樣本含油脂過高時，此時可見試管底部殘留有黃色粘稠狀液滴）；

4）加入1 ml 1×樣品復(fù)溶液，溶解混勻，取50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：2     檢測下限：0.1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前需配制標準品應(yīng)用液；低濃度的標準品不穩(wěn)定，需現(xiàn)配現(xiàn)用（配好的標品在4℃可穩(wěn)定1個月）。

在0ppb的瓶中加1×樣品復(fù)溶液3ml，0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb的瓶中分別加1×樣品復(fù)溶液1.5ml，0.4ppb的瓶中加1×樣品復(fù)溶液2.88ml。

標準液6：取10ppb高濃度標準品溶液120ul加入裝有2.88ml 1×樣品復(fù)溶液的0.4ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.4ppb。

標準液5：取1.5ml標準液6加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液的0.2ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.2ppb。

標準液4：取1.5ml標準液5加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液0.1ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.1ppb。

標準液3：取1.5ml標準液4加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液的0.05ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.05ppb。

標準液2：取1.5ml標準液3加入裝有1.5ml 1×樣品復(fù)溶液的0.025ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.025ppb。

標準液1：直接使用1×樣品復(fù)溶液，濃度即為0ppb。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。